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GBT 18204.4-2013 公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物.pdf
1、范围
GB/T 18204的本部分规定了公共场所公共用品用具细菌总数、真菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的采样与测定方法。
本部分适用于公共场所内公共用品用具细菌总数、真菌总数、大肠菌群、金黄葡萄球菌以及溶血性链球菌的测定,其他场所可参照执行。
2、术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
细菌总数total bacterial count
公共用品用具经过采样处理,在营养琼脂培养基上经35℃～37 ℃,48 h培养所生长发育的嗜中温性需氧和兼性厌氧菌落的总数。
2.2
大肠菌群coliforms
在37 ℃,24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气.需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌2.3
金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus
在Baird Parker培养基或血平板培养基上生长良好,分解甘露醇产酸,血浆凝固酶阳性的革兰氏阳性葡萄状球菌。
2.4
真菌总数total fungi count
在孟加拉红或沙氏琼脂培养基上经25笆〜28 °C、3 d〜7 d培养所形成菌落的总数。
2.5
溶血性链球菌 streptococcus hemolyticus
属于链球菌属，为革兰氏阳性菌，分解葡萄糖，产酸不产气，血平板上产生溶血圈。
在孟加拉红或沙氏琼脂培养基上经25 ℃~28 ℃、3 d~7 d培养所形成菌落的总数。
3、细菌总数平皿计数法
3.1培养基与试剂
3.1.1 生理盐水成分:
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
制法:称取8.5 g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中,分装到试管内,每管10 mL,121℃高压灭菌15 min。
3.1.2营养琼脂成分：
蛋白臉
牛肉膏
氯化钠
琼脂
蒸馅水
制法:将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7. 4〜7.6,分装于玻璃容器内，经103.43 kPa （121 °C ,15 lb）灭菌20 min,储存于冷暗处备用。
3.2仪器和设备
高压蒸汽灭菌器°
样品的稀释:将放有采样后棉拭子的试管充分振摇,此液为1 ： 10的样品匀液。用1 mL无菌吸 管或微量移液器吸取1 ： 10样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于盛有9 mL生理盐水稀释液（3.1.1）的无菌 试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均 匀，制成1 : 100的样品匀液。按同法制备10倍系列稀释祥品匀液，每递增稀释1次，换用1次1 mL无 菌吸管或吸头。
3.3.3样品的接种:根据对样品污染状况的估计，选择1个〜2个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍 递增稀释时,每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL稀释液加入两 个无菌平皿作空白对照。
334样品的培养：及时将15 mL〜20 mL冷却至45 °C〜50 °C的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 °C±1 °C恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。琼脂凝固后，将平板翻转， 36 °C±1 °C培养 48 h±2 h。
干热灭菌箱。
恒温培养箱：36笆士1 °C。
冰箱。
电炉或微波炉。
天平:感量0.1 go 涡旋混合器。
无菌试管、平皿（直径9 cm）、刻度吸管等& 灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
pH计或精密pH试纸。
放大镜或（和）菌落计数器。
3.3检验步骤
3.4菌落计数 3.4.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量（CFU）。
3.4.2选取菌落数在30 CFU〜300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于30。CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的 平均数。
3-4.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜釆用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
2度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以
2,代表一个平板菌落数。
3.4.4平板内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），应将每条链（不同来源）作为一个菌落计。
3.5不同稀释度菌落计数计算规则
3.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值,再将均 值乘以相应稀释倍数，作为每毫升中菌落总数结果。
3.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，则总菌落数按式（1）计算，示例见表 2 SC
4大肠菌群多管发酵法
4.1培养基和试剂 4.1.1乳糖胆盐发酵培养液
成分：
蛋白臃
猪胆盐（或牛、羊胆盐）
乳糖
漠甲酚紫水溶液（质量浓度= 0.04%）
蒸馆水
制法:将蛋白臉、胆盐及乳糖溶于蒸储水中，调pH至7.4,加漠甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管 的试管中，每管10 mLo经68.96 kPa（115 °C ,10 lb）高压灭菌20 mino
注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸儲水外，其他成分加倍。
4.1.2伊红美蓝琼脂
成分：
蛋白臃
乳糖
磷酸氢二钾
琼脂
伊红水溶液（质量浓度=2 % ）
美蓝水溶液（质量浓度= 0.5%）
蒸储水
制法:将蛋白臉、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馆水中，调整pH至7.2,分装到烧瓶内。经68.96 kPa （115 °C ,10 lb）高压灭菌20 min,临用时加入乳糖并加热熔化琼脂，冷至50 °C~55 加入伊红和美蓝 溶液，摇匀，倾注平皿。
4.1.3乳糖发酵管
成分：
蛋白腺 20
乳糖 10
漠甲酚紫水溶液（质量浓度-0.04%） 25
蒸馆水
制法:将蛋白腺及乳糖溶于水中，调pH至7.4,加入指示剂，分装到带有倒管的试管中，每管3 mL, 经 68.96 kPa（115 °C,10 lb）高压灭菌 20 mino 4.1.4革兰氏染色液 4.141结晶紫染色液
成分：
结晶紫
乙醇（95%,体积分数）
5金黄色葡萄球菌平皿鉴定法
5.1培养基和试剂
5.1.1胰酪陈大豆肉汤
成分：
胰酪豚（或胰蛋白踪）
植物蛋白豚（或大豆蛋白踪）
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馋水
制法:将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2〜7.3,分装，121 °C、20 min高压灭菌。
结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验 阳性，可报告检出金黄色葡萄球菌。
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